Salmon (1) est une application de quantification qui ne demande pas l'alignement préalable des séquences FASTQ sur un génome de référence. À partir d'un index des séquences contenu dans un transcriptome de référence, Salmon en mode mapping procède à un alignement et crée un table de l'abondance de chaque transcrit représenté dans les fichiers FASTQ paired-end.

Note importante: Salmon ne fait pas la découverte de nouveau transcrits pas plus qu'il ne peut trouver de nouveaux exons. Il trouvera uniquement les séquences qui sont représentées dans le transcriptome de référence.

• En premier, assumons que nous avons des fichiers paired-end en format FASTQ qui ont été filtrés pour en retirer les séquences de mauvaise qualité (selon vos critères).
• Deuxièmement, nous travaillons dans notre répertoire racine usager.

% cd && mkdir monAnalyse

• Finalement, nous avons des fichiers d'annotations des transcrits pour le génome étudié. Pour notre exemple, nous utiliserons les fichiers provenant du projet Gencode.

% mkdir salmonIndexes
% cd salmonIndexes
% curl -L -O ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_32/gencode.v32.transcripts.fa.gz
% unzip gencode.v32.transcripts.fa.gz

• Il faut utiliser salmon en mode index afin de créer l'index de recherche que salmon utilisera pour sa recherche de transcrits.
• En assumant que nous sommes toujours dans ~/salmonIndexes et que salmon se trouve dans $PATH (ce qui devrait être le cas si vous avez suivi la recette), utilisez la ligne de commande suivante:

% salmon index -t gencode.v32.transcripts.fa -i human.gencode.v32.transcripts.index 

• À la fin du processus, vous trouverez dans le répertoire salmonIndexes un nouveau répertoire appelé human.gencode.v32.transcripts.index contenant un série de fichiers que salmon utilisera pour sa recherche.
• Il va s'en dire que cette indexation devra être refaite à chaque mise à jour du fichier de transcrits.

• On remonte d'un niveau et on s'en va dans notre dossier d'analyse:

% cd ../monAnalyse

• Assumons que les fichiers FASTQ sont dans une arborescence logique (pour permettre une certaine automation; projet à venir…):

% ls PATH/vers/fichiers/FASTQ
sample_1_ctrl
  sample_1_ctrl.filtered.R1.fastq.gz
  sample_1_ctrl.filtered.R2.fastq.gz
sample_2_ctrl
  etc...
sample_3_ctrl
  etc...
sample_1_treated
  etc...
sample_2_treated
  etc...
sample_3_treated
  etc...

• On calque cette structure dans notre répertorie d'analyse:

% for i in 1..3; do mkdir sample_$i_ctrl;done
% for i in 1..3; do mkdir sample_$i_treated;done

• On se dirige dans le premier et on lance l'analyse quantitative salmon:

% cd sample_1_ctrl
% salmon quant -i ~/salmonIndexes/human.gencode.v32.transcripts.index \
         -1 PATH/vers/fichiers/FASTQ/sample_1_ctrl/sample_1_ctrl.filtered.R1.fastq.gz \
         -2 PATH/vers/fichiers/FASTQ/sample_1_ctrl/sample_1_ctrl.filtered.R2.fastq.gz \
         -l A -p 8 --validateMappings -o ./sample_1_ctrl_quant

• Plus à venir…